产品描述　　Quick Cell PCR法支原体检测试剂盒，本试剂盒采用一对支原体特异性引物，用于对样品的支原体基因组DNA进行PCR扩增，然后通过琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测。试剂盒内同时含有内参对照，用于监控PCR是否正常扩增。

　　本试剂盒与MB Zell Shield 13-0050等产品相比更具优势，替代性强，具体情况可详见下文或咨询销售人员。　　本试剂盒是一种广谱的支原体检测试剂盒，可以识别所有100多种至今已发现的支原体；能用于检测一切可能含支原体的样品，比如：体外细胞培养的上清；血清；各种体液，如唾液、尿液、鼻腔分泌物等；其他液体样品等。具有100%支原体识别率、灵敏度极高、含内参条带从而可以区分真阴性样品和假阴性样品、无需配套相对昂贵的荧光定量PCR仪等优点。　　经多次测试，本试剂盒有记录可以识别在体外细胞培养中曾经报道出现的20种支原体，根据文献报道，这些支原体基本能占污染细胞的支原体种类的100%。具体如下：（1）M. hyorhinis、（2）M. fermentans、（3）M. arginini、（4）M. hominis、（5）M. orale、（6）M. salivarium、（7）M.pirum、（8）A. laidlawii、（9）M. agalactiae、（10）M. bovis、（11）M. bovoculi、（12）A. axanthum、（13）M. buccale、（14）M. pneumoniae、（15）M. arthritidis、（16）M. pulmonis、（17）M. gallisepticum、（18）M. gallinarum、（19）M. canis、（20）Ureaplasma urealyticum（注：M.为Mycoplasma的缩写; A.为Acholeplasma的缩写）。 订购信息

【注】：以下试剂需要自行准备：①普通的Taq DNA 聚合酶（推荐使用 Takara 品牌的Ex Taq Hot Start version，货号：RR006A，已包含2.5 mM 的 dNTP）和相应的缓冲液；② 2.5 mM的dNTP；③DNA上样缓冲液（推荐使用李记生物的GelRed预染DNA上样缓冲液(5X)，货号：AN34L047，该缓冲液已含无毒核酸染料，不需要接触 EB 等致癌物质）。 运输与保存条件　　冰袋运输，-20℃保存，可以保存五年。 使用方法 1.待测样品的准备 取换液后培养2-3 d且汇合度在90%左右的细胞培养液上清（贴壁细胞）。悬浮培养的细胞在换液传代后，生长2-3 d再取培养液进行检测。可以按照以下两种方法之一进行样品的前处理： 方法一（1）取 150μL上述待测样品到1.5 mL离心管内，在普通台式离心机上1000 rpm 低速离心5 min；（2）上述离心上清液，95 ℃加热处理5 min（可以转移到 PCR 管内，在 PCR 仪上进行加热处理），简单离心（1000g，5 s）后，取上清进行检测。 方法二（推荐本方法，有高速离心机的的可选用本方法，可以去PCR抑制物，准确性更高。）（1）根据浓缩倍数，可以取100 - 1500μL上述待测样品到1.5 mL离心管内，普通台式离心机1000 rpm 离心5 min，将离心后的上清转移到另一个离心管内，丢弃细胞沉淀。（2）将上清继续13000 rpm（约16000 g）高速离心5 min，小心吸走全部上清，用50μL 5 mM Tris-HCl,pH 8.5（推荐使用，样品可以长期保存）或者去离子水（样品比较不稳定，只适合当天或短期内检测使用）重悬、沉淀（沉淀中含有支原体），吹吸均匀。（3）该重悬后的样品可以直接检测，也可以进行热处理后再检测（热处理后，样品保存更稳定）。热处理具体如下：95 ℃加热处理 5 min（可以转移到PCR管内，在PCR仪上进行加热处理），简单离心（1000g，5 s）后，取上清进行检测。 【注】：① 这里的细胞培养上清不是指细胞经胰酶消化后的离心上清，而是指至少培养 2 d后的贴壁细胞培养液上清或悬浮细胞培养液； ② 本步骤的低速离心是为了去除哺乳动物细胞，以排除其不必要的干扰。所以离心力要严格控制在150-200 g，该离心力下，哺乳动物细胞将被沉淀下来而支原体不会；③ 收集的待测细胞培养液样品如果不立即检测，请放于-20℃或-80℃冰箱保存；④ 如果预期待测样品支原体含量较少（比如低温保存的血清、脐带血、胰mei、抗生素、未使用的培养液、生物制品、极个别细胞培养上清等），可以采取措施以提高检测的灵敏度，具体方法请看后文注意事项部分：如何提高本试剂盒检测灵敏度。 2.PCR 体系的配制  （1）按照25μL体系配制比例如下。如果是多样品检测，加两个对照样品后各组分总体积如下表。配制好的混合液，按每管23μL分装到0.2 mL的PCR管中。

【注】：① 总体积中多配制 6% 是为了防止移液导致误差，以保证每个反应管中的反应液足量； ② 如果有条件，PCR 体系的配制建议在冰上进行操作；③ 本试剂盒不推荐使用 2× 的 PCR mixture（内含 Taq 酶、缓冲液和 dNTP），建议使用Taq酶、10×Taq 缓冲液和 dNTP 等试剂配制PCR体系；④ 为了避免可能的污染，收到的支原体引物和内参，可以适当分装（比如：每支 40μL）后冷冻保存；⑤ 如果使用的是其他 Taq 酶（前提是：阴性对照的 586 bp 内参条带必须有一定亮度，且稳定性良好，否则不能使用），酶、去离子水的加入量需要根据其说明书进行调整。（2）加入待测样品、阴性和阳性对照样品。样品检测管中加入2μL待测样品，阴性对照管加入2μL去离子水，阳性对照管加入2μL阳性支原体 DNA。【注】：① 装有阳性支原体 DNA 的螺口管开盖之前，低速离心或用手指捏住，用力甩一下即可；② 进行反应体系配制的房间，与样品前处理、加阳性对照DNA、样品DNA的房间建议分开。 3.PCR 参数设置

4.PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳 　　配制含溴化乙锭（EB）的浓度为 1.5%的 DNA 琼脂糖凝胶（推荐使用李记生物的GelRed预染DNA上样缓冲液(5X)，货号：AN34L047，该产品预添加了无毒安全染料）；当溴酚蓝染料跑出上样孔 3-4 cm时，停止电泳，拍照。 5.结果判断  PCR 扩增的结果有可能出现以下几种情况：

【注】：“-"代表没有条带；“+"代表有条带；“+"号越多代表条带越强。　　支原体 PCR 扩增结果：586 bp 条带为内参条带，270 bp 左右的条带为支原体特异条带（各支原体的条带大小会略有不同，总体在 266-280 bp 之间。注意：支原体特异条带的大小不会超过该范围。超过该范围的，就是杂带！）。随着支原体 DNA 模板的增加，270 bp 左右的条带会逐渐增强而 586 bp 的内参条带会逐渐减弱，甚至消失。　　泳道1：阴性对照或者没有支原体污染的样品； 　　泳道2：极重度支原体污染样品； 　　泳道3：重度污染样品； 　　泳道4：中度污染样品； 　　泳道5：轻度污染样品； 　　泳道6：PCR 的扩增被细胞的代谢产物抑制，导致扩增失败。　　M：DNA marker.注意事项1.设有阴性对照，保证本试剂盒含有的支原体引物和内参以及整个反应体系正常。2.只有当阴性对照的结果没有出现 270 bp 左右的支原体特异条带时，其他样品的检测结果才是可信的。3.每次试验阴性对照中 586 bp 的内参条带都必须出现而且要有一定的亮度，才说明试验成功。如果阴性对照的内参条带经常没有出现或者非常弱，说明试验不成功，这时可以采取以下几个措施： a.请使用普通蒸馏水或去离子水。不能使用去内毒素的水、DEPC 处理的水或者商品化的 DNase/RNase-free的水，这几种水都可能会抑制 PCR 扩增的效率。 b.请使用 Takara 公司的 Ex Taq Hot Start version（推荐。货号： RR006A，可用 400 次）。 c.可以尝试增加 PCR 的循环数，比如：由原来的 40 个循环，增加到 45 个循环。如果采取以上几个措施后，阴性对照的内参条带仍然经常没有出现或者非常弱，请联系厂家解决。4.如果直接使用细胞培养液上清进行检测，而检测结果显示该样品 586 bp 条带和 270 bp 左右的条带都没有出现（如图 1，泳道 6）或者内参条带非常微弱，在排除 PCR试剂的问题后,说明该样品含有抑制 PCR 扩增的代谢产物。5.防 DNA 污染注意事项： a.强烈建议所有操作全部使用进口滤芯吸头（比如：Axygen 滤芯吸头）进行操作，以免试剂被污染。 b.“PCR 体系配制的房间、移液枪"（不要使用细胞培养室的移液枪！）和“PCR 产物的电泳房间、移液枪"一定要分开，不能在同一个房间进行，也不能使用相同的移液枪进行操作。 c.PCR 产物是导致假阳性的主要原因，PCR 产物不要在 PCR 体系配制的房间中打开。 d.样品处理的房间和移液枪，如有条件，建议也分开。 e.收到的支原体引物和内参，可以分装（比如 40 μL一支）后保存。6.如发现细胞被支原体污染，推荐使用李记生物的Quick Cell支原体祛除预防试剂盒，货号：AC16L066；以及EZ 水浴锅抑菌剂，货号：AC16L162 和 EZ 细胞房除菌剂，货号：AC16L143。产品详情可咨询销售人员或见李记生物网站。7.支原体检测样品可以分成两类：①用含血清的培养液培养的哺乳动物细胞上清液，由于该条件非常适合支原体生长，培养数天后，支原体密度一般较高，可达 10^7-9/mL，可以直接检测。②低温保存的血浆、血清、脐带血、胰酶、抗生素、未使用的培养液等样品，由于这些样品即使有支原体污染，支原体含量一般很少，直接使用快速支原体检测试剂盒进行检测，往往检测不出来。这些样品建议：（1）对样品的支原体进行离心浓缩处理；（2）使用支原体液体培养基（必须同时接种不含jing氨酸和含jing氨酸的两种支原体液体培养基）培养 3-7 d后，再进行检测。具体方法请参考李记生物 Quick Cell 发光法支原体检测试剂盒，货号：AC16L062 说明书中后的注意事项部分。该方法速度较慢，需要 3-7 d，但是可靠性高。8.该产品主要用于细胞上清支原体污染检测，仅限于科学实验研究使用，不得用于临床诊断、治疗等领域。相关产品推荐Quick Cell支原体快速检测试剂盒(细胞培养)（货号：AC16L061）Quick Cell 发光法支原体检测试剂盒（货号：AC16L062）Quick Cell支原体祛除预防试剂盒（货号：AC16L066）